本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫學(xué)診斷

大鼠（Rat）骨特異性堿性磷酸酶（B-ALP）

ELISA檢測試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被骨特異性堿性磷酸酶（B-ALP）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹-底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的骨特異性堿性磷酸酶（B-ALP）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長(cháng)下測定吸光度（OD 值），計算樣品活性。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì )有結晶，這屬于正?，F象，水浴加熱使結晶完-全溶解后再使用。

2.  實(shí)驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  濃度為0的S0號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說(shuō)明書(shū)操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。

4.  嚴格按照說(shuō)明書(shū)中標明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑盒組成

注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、3、6、12、24、48 U/L

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20稀釋?zhuān)?份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗板：甩盡孔內液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min后甩盡孔內液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。

結果判斷

 繪制標準曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計算各樣本濃度值。

試劑盒性能

1.  準確性：標準品線(xiàn)性回歸與預期濃度相關(guān)系數R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度：最-低檢測濃度小于1.0 U/L。

3.  特異性：不與其它可溶性結構類(lèi)似物交叉反應。

4.  重復性：板內、板間變異系數均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(gè)月

免責聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗或人體實(shí)驗，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗者承擔，本公司概不負責。

2.   嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作，實(shí)驗者違反說(shuō)明書(shū)操作，后果由實(shí)驗者承擔。